บทนำ

          กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด (Scanning Electron Microscope / SEM) หรือนิยมเรียกกันสั้น ๆ ว่า กล้อง SEM เป็นเครื่องมือวิทยาศาสตร์ที่พัฒนาขึ้นเพื่อตอบสนองความต้องการของมนุษย์ที่ต้องการเห็นสิ่งมีชีวิตที่มีขนาดเล็กและต้องการเห็นรายละเอียดทางสัณฐานวิทยา ถูกสร้างขึ้นครั้งแรกเมื่อปี ค.ศ. 1983 โดยนักฟิสิกส์และนักประดิษฐ์ชาวเยอรมัน ชื่อว่า  Manfred Von Ardenne โดยใช้หลักการปล่อยอิเล็กตรอนให้ตกกระทบลงบนผิวตัวอย่างและมี scanning coil ทำหน้าที่กราดลำอิเล็กตรอนไปบนตัวอย่าง เมื่ออิเล็กตรอนตกกระทบที่ผิวตัวอย่างจะเกิดอิเล็กตรอนสะท้อนกลับเรียกว่า secondary electron ซึ่งจะมีตัวรับสัญญาณ (detector) ทำหน้าที่แปลงสัญญาณอิเล็กตรอนมาเป็นสัญญาณภาพ

ภาพหลักการทำงานกล้อง SEM ที่มา pantip.com/topic/33248513

โดยตัวอย่างที่จะทำการศึกษาด้วยกล้อง SEM นั้นต้องมีลักษณะและคุณสมบัติดังนี้

1) ตัวอย่างต้องเป็นของแข็ง นิ่ง และคงรูปเมื่ออยู่ในสภาวะ สุญญากาศ

2) ไม่มีความชื้น ไม่มีน้ำมัน

3) มีคุณสมบัตินำไฟฟ้า

เนื่องจากตัวอย่างที่จะเข้าศึกษาด้วยกล้อง SEM ต้องมีคุณสมบัติดังกล่าวข้างต้นจึงได้มีการศึกษาค้นคว้าวิธีการเตรียมตัวอย่างเช่น พืช สัตว์ เนื้อเยื่อ หรือ จุลินทรีย์เพื่อให้มีคุณสมบัติที่เหมาะสมที่จะเข้าศึกษาด้วยกล้อง SEM ได้โดยมีขั้นตอนดังนี้

1) การเลือกและเก็บตัวอย่างเพื่อให้ได้ลักษณะตัวอย่างที่เหมาะสมเพราะตัวอย่างทางชีววิทยามีปัจจัยแวดล้อมที่ส่งผล เช่น ความชื้น ขนาดของตัวอย่าง รูปร่างลักษณะที่ต้องการศึกษา

2) กระบวนการตรึงตัวอย่าง (Fixation) คือ ขั้นตอนแรกที่สำคัญภายหลังจากการเก็บตัวอย่างมีวัตถุประสงค์เพื่อคงสภาพตัวอย่างไม่ให้เสียสภาพ วิธีการตรึงสามารถแบ่งออกได้เป็น 2 ประเภทได้แก่ การตรึงทางกายภาพได้แก่ cryofixation คือการใช้ความเย็นของ liquid nitrogen ในการคงรูปตัวอย่างและการตรึงทางเคมีคือการใช้สารละลาย ได้แก่ formaldehyde, glutaraldehyde, osmium tetroxide ที่เป็นสารละลายอยู่ในบัฟเฟอร์โดยนำตัวอย่างใส่ลงไปในสารละลายดังกล่าวข้างต้นให้ท่วมตัวอย่างเพื่อรักษาโครงสร้างของตัวอย่างซึ่งโดยส่วนใหญ่ตัวอย่างทางชีวภาพจะประกอบไปด้วย โปรตีน ไขมัน และ น้ำเป็นองค์ประกอบหลัก

3) กระบวนการดึงน้ำออกจากตัวอย่าง (Dehydration) คือกระบวนการแทนที่น้ำด้วยแอลกอฮอล์โดยเริ่มจากแอลกอฮอล์ความเข้มข้นน้อยไปจนถึง absolute ethanol เพื่อให้มั่นใจว่าในตัวอย่างไม่มีน้ำหลงเหลืออยู่ภายใน

4) กระบวนการทำแห้ง (Critical point drying) คือกระบวนการแทนที่แอลกอฮอล์ในตัวอย่างด้วยคาร์บอนไดออกไซด์เหลวหลังจากนั้นทำการระเหยคาร์บอนไดออกไซด์ที่อุณหภูมิประมาณ 40 องศาเซลเซียสภายใต้ความดัน โดยเครื่องมือทำแห้งเรียกว่าเครื่อง Critical point dryer : CPD

5) นำตัวอย่างที่ผ่านกระบวนการทำแห้งเรียบร้อยแล้วมาติดลงบนแท่นติดตัวอย่าง (stub) โดยการติดตัวอย่างต้องใช้ความระมัดระวังอย่างมากเพราะว่าตัวอย่างมีความบอบบาง

6) นำตัวอย่างที่ติดลงบน stub เรียบร้อยแล้วไปเข้าเครื่องฉาบทอง (sputter) เพื่อให้ตัวอย่างมีคุณสมบัตินำไฟฟ้าและนำเข้าศึกษาด้วยกล้อง SEM

          จากขั้นตอนดังกล่าวข้างต้นทำให้ทราบว่าหากต้องการศึกษาตัวอย่างทางชีววิทยาด้วยกล้อง SEM จึงต้องมีการเตรียมตัวอย่างตามขั้นตอนดังกล่าวข้างต้น

ยุงลาย (Aedes) เป็นหนึ่งในสายพันธุ์ยุงที่มีมากกว่า 4,000 ชนิดในโลก ยุงลายนั้นเป็นพาหะนำโรคไข้เลือดออก (Dengue fever) มีอยู่ 2 ชนิดได้แก่ ยุงลายบ้าน (Aedes aegypti) และ ยุงลายสวน (Aedes albopictus) ยุงลายมีวงจรชีวิตที่มีลักษณะและรูปร่างที่มีความแตกต่างกันอย่างชัดเจน

โดยมีทั้งหมด 4 ระยะ ได้แก่ ระยะไข่ (egg) ระยะลูกน้ำ (larva) ระยะตัวโม่ง (pupa) และระยะตัวเต็มวัย (adult) ยุงลายในระยะตัวเต็มวัยมีลักษณะดังต่อไปนี้

1) ร่างกายอ่อนนุ่ม เปราะบาง แบ่งเป็น3 ส่วนแยกออกจากกัน เห็นได้ชัดเจนคือ ส่วนหัว ส่วนอกและส่วนท้อง ลำตัวยาวประมาณ4-6 มม. มีเกล็ดสีดำสลับขาวตามลำตัวรวมทั้งส่วนหัวและส่วนอกด้วย 

2) มีขา6 ขาอยู่ที่ส่วนอก ขามีสีดำสลับขาวเป็นปล้องๆ ที่ขาหลังบริเวณปลายปล้องสุดท้ายมีสีขาวตลอด

3) มีปีกที่เห็นได้ชัดเจน1 คู่ อยู่บริเวณส่วนอก ลักษณะของปีกบางใส มีเกล็ดเล็ก ๆ บนเส้นปีก

4) มีปากยาวมากลักษณะปากเป็นแบบแทงดูด

5) เส้นหนวดประกอบด้วยปล้องสั้น ๆ14 ถึง15 ปล้อง ที่รอยต่อระหว่างปล้องมีขนขึ้นอยู่โดยรอบ ในยุงตัวผู้เส้นขนเหล่านี้ยาวมาก (ใช้รับคลื่นเสียงที่เกิดจากการขยับปีกของยุงตัวเมีย) มองดูคล้ายพู่ขนนก ส่วนในยุงตัวเมียเส้นขนที่รอยต่อระหว่างปล้องจะสั้นกว่าและมีจำนวนน้อยกว่า ลักษณะของหนวดยุงจึงใช้ในการจำแนกเพศของยุงได้

เนื่องจากยุงลายเป็นพาหะนำโรคไข้เลือดออกจึงได้มีงานวิจัยศึกษาลักษณะทางสัณฐานวิทยา ลักษณะทางพันธุกรรม รวมถึงการหาสารสกัดทางธรรมชาติเพื่อยับยั้งวงจรชีวิตของยุงลาย การจะศึกษาลักษณะทางสัณฐานวิทยาของยุงลายในระยะตัวเต็มวัยด้วยกล้อง SEM นั้นต้องผ่านขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างด้วยกระบวนการทางเคมีโดยทั่วไปมีขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างดังนี้

ขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างทางชีววิทยาสำหรับกล้อง SEM

ภาพถ่ายเครื่อง SEM ยี่ห้อ JEOL รุ่น JSM-6610LV

วิธีการทดลอง

          เก็บตัวอย่างยุงระยะตัวเต็มวัยโดยใช้ aspirator (หลอดดูดยุง) ดูดยุงมาประมาณ 10 ตัว ใส่ในถุงร้อนและมัดปากถุงด้วยหนังยางจากนั้นนำไปแช่ในตู้เย็นช่องธรรมดาอุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 6 ชั่วโมง         เมื่อครบ  6 ชั่วโมง ใช้ฟอร์เซปคีบยุงเพื่อมาใส่ในสารละลาย 2.5% glutaraldehyde

          เมื่อนำยุงที่ผ่านกระบวนการเตรียมเป็นที่เรียบร้อยแล้วเข้าศึกษาด้วยกล้อง SEM พบว่ามีการยุบตัวของตัวอย่าง และการหักหลุดของอวัยวะบางส่วนอีกด้วยแสดงได้ดังภาพถ่ายดังนี้

ภาพถ่ายยุงที่อยู่ใน 70% alc.

          จากที่ผ่านกระบวนการเตรียมตัวอย่างและสังเกตตามขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างข้างต้น พบว่าตัวอย่างยุงจะเริ่มจมในสารละลายที่แอลกอฮอล์ความเข้มข้น 50% และจมอยู่ในของเหลวอย่างสมบูรณ์ที่แอลกอฮอล์ความเข้มข้น 70% จึงได้ทดลองเตรียมตัวอย่างโดยข้ามขั้นตอนการ fixation มาเป็นเก็บรักษาตัวอย่างด้วยแอลกอฮอล์ความเข้มข้น 70% แทน วิธีการนี้ช่วยลดระยะเวลาและไม่ต้องใช้ความระมัดระวังมากนักในระหว่างการเตรียมตัวอย่าง

          เมื่อนำตัวอย่างเข้าศึกษาด้วยกล้อง SEM พบว่าตัวอย่างยุงอยู่ในสภาพที่ค่อนข้างสมบูรณ์ มีการหักหลุดผิดรูปของตัวอย่างน้อยมาก ดังภาพที่จะแสดงเปรียบเทียบให้เห็นได้อย่างชัดเจน

สรุปผลการทดลอง

          จากการศึกษาภาพถ่ายตัวอย่างยุงลายระยะตัวเต็มวัยที่ผ่านการเก็บรักษาตัวอย่างใน 70% แอลกอฮอล์นั้นพบว่าเมื่อนำมาศึกษาด้วยกล้อง SEM ให้ลักษณะทางสัณฐานวิทยาที่ไม่ได้แตกต่างกับตัวอย่างที่เก็บรักษาใน 2.5% glutaraldehyde อีกทั้งยังพบว่ารายละเอียดของตัวอย่างเช่น ปีก ขา ขน รูปร่างบริเวณช่วงอกและท้องอยู่ในสภาพที่สมบูรณ์กว่าอีกด้วย ข้อสำคัญอีกประการหนึ่งคือช่วยลดเวลาในการเตรียมตัวอย่างได้ค่อนข้างมากทีเดียว

ประโยชน์ที่คาดว่าจะได้รับ

          วิธีการดังกล่าวอาจเป็นแนวทางในการนำไปประยุกต์ใช้กับตัวอย่างทางชีววิทยาที่ไม่สามารถจมอยู่ในสารละลาย 2.5% glutaraldehyde ให้สามารถเตรียมตัวอย่างเพื่อที่จะศึกษาด้วยกล้อง SEM ได้ ซึ่งอาจจะลดความเข้มข้นของแอลกอฮอล์ในการเก็บรักษาตัวอย่างลงเพื่อความเหมาะสมของตัวอย่างแต่ละชนิดเพราะว่าตัวอย่างทางชีวภาพมีความบอบบางและรายละเอียดที่แตกต่างกันการใช้แอลกอฮอล์ความเข้มข้นมากเกินไปเริ่มต้นในการเก็บรักษาตัวอย่างอาจทำให้เกิดผลเสียกับตัวอย่างได้ เช่น บริเวณผิวตัวอย่างอาจเกิดการปริแตกได้ถ้าตัวอย่างนั้นมีผิวเนื้อเยื่อที่บอบบาง หรืออาจจะเกิดการยุบตัวผิดรูปของตัวอย่างซึ่งเกิดจากการดึงน้ำออกจากตัวอย่างที่เร็วเกินไป อีกทั้งระยะเวลาในการเก็บรักษาตัวอย่างที่อยู่ใน 70% แอลกอฮอล์อีกด้วย